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Molekularbiologische Methoden 2.0

von Reinard, Thomas Fach: Biologie/ Ökologie;

Von den Grundlagen der Laborarbeit über aktuelle Methoden und Verfahren bis zum Fortgeschrittenenwissen

Die Molekularbiologie hat sich in den letzten Jahren rasant weiterentwickelt. Vor wenigen Jahren noch völlig unbekannte Technologien und Verfahren, wie die Modulare Klonierung, PCR-basierte Klonierungen oder das Gibson Assembly gelten heute als Standard.

Dies ist das bislang einzige Methodenbuch, das die neuen, inzwischen weit verbreiteten Verfahren, wie Gibson Assembly, Golden Gate, MoClo und Genom Editierung, beschreibt.

Diese und viele andere zukunftsweisenden Verfahren wurden aussagekräftig illustriert, zahlreiche Wissensboxen, Tipps und Protokolle machen den Titel zum perfekten Praxisbegleiter. Ideal für Bachelor- und Master-Studierende und für Berufspraktiker!
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Details
ISBN 9783825287429
UTB-Titelnummer 8449
Auflagennr. 2. vollst. überarb. u. erw. Aufl.
Erscheinungsjahr 2018
Erscheinungsdatum 10.09.2018
Einband Kartoniert
Formate UTB L (17 x 24 cm)
Originalverlag Ulmer
Umfang 328 S., 145 farb. Abb., 50 Tab.
Zusatzmaterial
Inhalt
Vorwort zur 1. Auflage 12
Vorwort zur 2. Auflage 13
1 Das Leben und seine Bestandteile
1.1 Der Aufbau von DNA und RNA 17
1.2 Der genetische Code 20
1.3 Die Gene 22
1.3.1 Die Genstruktur in Prokaryoten 22
1.3.2 Genstruktur in Eukaryoten 24
1.4 Proteine 26
1.5 Die Zelle 30
2 Grundlagen der Arbeit im Labor
2.1 Wasser 34
2.2 Messung des pH-Werts 35
2.3 Puffer 36
2.4 Waagen 36
2.5 Mikropipetten 38
2.6 Gefäße im Labor 40
2.7 Zentrifugen 41
2.8 Mischen und Konzentrieren 44
2.8.1 Konzentrieren 45
2.8.2 Pufferwechsel 45
2.9 Probenlagerung 46
2.10 Steriles Arbeiten 46
2.11 Geräte für den Aufschluss von Geweben 49
2.12 Pflege und Aufzucht von Escherichia coli 51
2.12.1 Nährmedien 52
2.12.2 Antibiotika 53
2.12.3 Lagerung von Bakterien 55
3 Aufreinigung von Nukleinsäuren
3.1 Gegenspieler erfolgreicher DNA- und RNA-Isolationen 59
3.1.1 Nukleasen 59
3.1.2 Scherkräfte 60
3.1.3 Chemische Verunreinigungen 60
3.1.4 EDTA und zweiwertige Ionen: das Yin und Yang der Molekularbiologie 61
3.2 Extraktion von Nukleinsäuren 62
3.3 Die weitere Aufreinigung der DNA 64
3.3.1 Phenolextraktion 64
3.3.2 Ethanolfällung 65
3.3.3 Isopropanolfällung 67
3.3.4 PEG-Fällung 68
3.3.5 Entfernen von Polysacchariden mit CTAB 68
3.3.6 Tropfendialyse 68
3.4 Silica Matrices 69
3.4.1 Von Nukleinsäuren und Silica Matrices 69
3.4.2 Übersicht über den Einsatz von Kits 70
3.5 Ausgewählte DNA Aufreinigungsverfahren 71
3.5.1 Die Plasmidpräparation aus E. coli 71
3.5.2 Die Isolation von DNA aus Pflanzen mit CTAB 72
3.5.3 Isolation von DNA aus Blut oder Zellkulturen 74
3.5.4 Isolation hochmolekularer DNA 75
3.6 Die Isolation von RNA 76
3.7 Tipps zum Erzielen hoher Ausbeuten bei der Isolation von Nukleinsäuren 78
3.8 Quantifizierung von Nukleinsäuren 79
3.8.1 DNA-Bestimmung im Photometer 79
3.8.2 Konzentrationsbestimmung mittels optischer Dichte 81
4 Polymerase- Kettenreaktion
4.1 Prinzip der Polymerase- Kettenreaktion 85
4.2 Die Komponenten der PCR 86
4.2.1 Die Ausgangs-DNA 86
4.2.2 Thermostabile DNA-Polymerasen 86
4.2.3 Puffer, Magnesium und dNTPs 89
4.2.4 Primer 91
4.3 Geräte für die PCR 93
4.4 Die Standard-PCR 94
4.5 Ausgewählte PCR-Methoden 94
4.5.1 Two-Step PCR 94
4.5.2 Gradienten-PCR und Touch-Down PCR 96
4.5.3 Nested PCR 97
4.5.4 Multiplex PCR 97
4.5.5 Einführen von Restriktionsschnittstellen 98
4.5.6 Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) 99
4.5.7 Kolonie-PCR 102
4.5.8 Quantitative PCR 103
4.6 Anwendungen der PCR 105
4.7 Optimierung der PCR-Reaktion 105
5 Klonieren für Einsteiger
5.1 Restriktionsenzyme 109
5.1.1 Restriktionsenzyme des Typs II 110
5.1.2 Restriktionsenzyme im Labor 113
5.1.3 Methylasen und Typ IIM-Enzyme 115
5.1.4 Typ IIS-Enzyme 116
5.2 Ligation 116
5.3 (De)Phosphorylierung von DN 118
5.3.1 Dephosphorylierung 118
5.3.2 Phosphorylierung 119
5.4 Enzyme für spezielle Aufgaben 121
5.5 Die Transformation von E. coli 121
5.6 Der Weg zum klonierten Gen 123
5.7 Der ungerichtete Einbau einer amplifizierten DNA in einen Vektor 123
5.7.1 Die Klonierung über eine Restriktionsstelle 124
5.7.2 TA-Klonierung und TOPO-Cloning 125
5.7.3 Klonierung in ein Letal-Plasmid 126
5.7.4 Zyklische Blunt End Klonierung 126
5.8 Der gerichtete Einbau von DNA in einen Vektor 127
5.9 Wenn es mal nicht klappt ... 129
6 Vektoren
6.1 Plasmide 132
6.2 Klonierungsplasmide 135
6.2.1 Blau-Weiß-Screening 135
6.2.2 Letalvektoren 138
6.3 Expressionsplasmide 139
6.3.1 Promotoren für Expressionsvektoren 140
6.3.2 Weitere regulative Sequenzen 141
6.3.3 Expression in das Periplasma 141
6.3.4 Einschlusskörperchen [Inclusion Bodies] 141
6.3.5 Tag-Sequenzen 142
6.4 Reportergene 142
6.5 Phagen 146
6.6 Phagemide 147
6.7 Shuttle-Vektoren 147
6.8 Künstliche Chromosome: YACs, BACs und PACs 148
6.9 Hefen als Klonierungs- und Expressionssystem 149
6.9.1 Hefe als Modellorganismus 149
6.9.2 Vektoren für Hefe 151
6.9.3 Transformation von Hefe 152
6.10 Pflanzen als Bioreaktoren 152
6.10.1 Die Transformation von Pflanzen 153
6.10.2 Transiente Transformationsverfahren 155
6.11 Die Transformation von Säugetieren und tierischen Zellkulturen 156
6.11.1 Säugetiere als Modellorganismen 156
6.11.2 Säuger-Zellkulturen 157
6.11.3 Vektoren für tierische Zellen 158
6.11.4 Transfektion tierischer Zellkulturen 159
7 Elektrophorese und Hybridisierung von Nukleinsäuren
7.1 Agarose-Gelelektrophorese von DNA 162
7.2. Die Detektion der DNA im Gel 167
7.3 Präparative Agarosegele 169
7.4 Auftrennen von RNA im Agarosegel 170
7.5 Fehlersuche bei Agarose-Gelelektrophorese 170
7.6 Hybridisierung von Nukleinsäuren 171
7.6.1 Southern und Northern Blot 173
7.6.2 Herstellung der Sonde und Hybridisierung 174
7.7 Microarrays 174
8 Fortgeschrittene Klonierung
8.1 Klonsammlungen und synthetische Gene 179
8.1.1 Klonsammlungen 180
8.1.2 Synthetische Gene und Genfragmente 180
8.2 Rekombinase-basierte Klonierung 181
8.3 Mutageneseverfahren 183
8.4 PCR-basierte Klonierungsverfahren: RF-Cloning und oePCR 186
8.5 Synthetische Biologie 188
8.6 Biobricks 189
8.7 Nahtlose Klonierungsverfahren 189
8.7.1 Golden Gate Klonierung 190
8.7.2 Cut-Ligation Verfahren 191
8.7.3 Multiple Insertionen mittels Golden Gate Klonierung 192
8.7.4 Golden Gate basierte Tool Kits am Beispiel des MoClo Kits 192
8.8 Gibson Assembly 195
8.9 Vergleich der Verfahren 198
9 Proteinaufreinigung
9.1 Homogenisation 203
9.1.1 Proteasen 204
9.1.2 Phenoloxidasen 206
9.2 Extraktion von Proteinen 207
9.2.1 Homogenisationspuffer 207
9.2.2 Abtrennen von Zell- und Gewebetrümmern 208
9.2.3 Fraktionierung des Rohextrakts 208
9.3 Dialyse und Konzentrierung 211
9.4 Weitere Aufreinigungsschritte 212
9.4.1 Chromatographie 213
9.4.2 Chromatographische Trennprinzipien 215
9.4.3 Magnetic Beads 216
9.5 Quantifizierung von Proteinen 217
9.5.1 Proteinbestimmung nach Bradford 217
9.5.2 BCA-Test 219
9.5.3 Welchen Test benutzen? 220
9.6 Aufreinigungsverfahren für getaggte Proteine aus E. coli 221
9.6.1 Bakterienanzucht und Homogenisation 222
9.6.2 Weitere Aufreinigung des heterologen Proteins 224
10 Gelelektrophorese von Proteinen
10.1 Die Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE) 229
10.2 Die denaturierende SDS-PAGE 229
10.2.1 Herstellung eines Proteinextrakts für die SDS-Gelelektrophorese 229
10.2.2 Herstellen des Gels 232
10.2.3 Der Gellauf 235
10.3 Das Färben der Gele 237
10.4 Weitere Elektrophoreseverfahren für Proteine 239
10.4.1 Native PAGE 239
10.4.2 Isoelektrische Fokussierung 239
10.4.3 2-D-Gelelektrophorese 239
10.5 Western Blotting 241
10.6 MassenspektrometrischeVerfahren 246
11 Immunbiochemische Methoden
11.1 Antikörper 251
11.2 Prinzipien immunbiochemischer Verfahren 254
11.2.1 Immunpräzipitation 254
11.2.2 Trägerbasierte Immunfärbung 256
11.2.3 Immobilisierung des Antigens 257
11.2.4 Blocken überschüssiger Bindestellen 257
11.2.5 Detektion der Bindung 257
11.2.6 Antikörper-Kaskaden 259
11.2.7 Spezifische und unspezifische Bindungen 260
11.3 ELISA 261
11.3.1 Sandwich-ELISA 263
11.3.2 Kompetitiver ELISA 265
11.4 Immunfärbung nach Western Blot 266
11.5 Immunaffinitätschromatographie 269
11.6 Weitere Antikörperbasierte Methoden 270
11.6.1 Rekombinante Antikörper 270
11.6.2 Phage Display und scFv 271
11.6.3 Immunhistochemische Verfahren 273
11.6.4 Markierung von Zellen 274
12 Fortgeschrittene Verfahren
12.1 DNA-Sequenzierung 278
12.1.1 Sequenzierung nach Sanger 278
12.1.2 Herstellen von Proben für die DNA-Sequenzierung 280
12.2 Next Generation Sequenzierung 281
12.3 Von den „Omics“ zur Systembiologie 285
12.4 Analyse der Genfunktion 286
12.4.1 Reverse Genetik und Gene Targeting 286
12.4.2 RNAi 287
12.4.3 Durchführung von siRNA-Experimenten 288
12.5 Genom Editierung 289
13 Bioinformatik
13.1 Datenbanken 296
13.2 Dateiformate 298
13.3 Sequenzsuche anhand von Stichwörtern (Entrez) 300
13.4 Sequenzsuche mit einer Sequenz (BLAST) 300
13.5 Bioinformatik zur Planung der Laborarbeit 305
14 Anhang
A1 Sicherheit im Labor 308
A2 Die 10 goldenen Laborregeln 309
A3 Das Laborbuch und die finale Arbeit 311
Verzeichnis der „Gut zu wissen“-Boxen 313
Abbildungsverzeichnis 314
Verzeichnis der Maps 316
Verzeichnis der Protokolle 316
Tabellenverzeichnis 317
Abkürzungsverzeichnis 318
Sachverzeichnis 321
Quellenverzeichnis 328
Pressestimmen
Aus: ekz-Informationsdienst, Themelidis, ID bzw. IN 2011/08
Dieses Buch stellt die gängigsten molekularbiologischen Labormethoden gut verständlich dar. Es richtet sich an Bachelor- und Masterstudenten im Bereich der Lebenswissenschaften und vermittelt zum einen die Grundlagen der Laborarbeit, Aufreinigung von DNA, RNA und Proteinen, Polymerasekettenreaktion und Klonierungsstrategien und vieles mehr bis hin zu molekularbiologischen Methoden für Fortgeschrittene. Vergleichstitel hierzu sind "Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics" (ID 31/02) und "Gentechnische Methoden" (ID 15/00). Das vorliegende Buch ist gut strukturiert und eignet sich sehr gut für Bibliotheken an Hochschul- und Wissenschaftsstandorten.
Autoreninfo

Reinard, Thomas

Dr. Thomas Reinard lehrt an der Leibniz Universität Hannover. 
Leserbewertungen

Bewertungen

Dozentenbewertung

Bewertung

Kundenmeinung von S. Peys

Der Aufbau des Buches gefällt mir sehr. Von der Probenlagerung bis hin zu den verschiedenen Färbungen ist alles anschaulich und gut beschrieben als auch illustriert. Ganz besonders gefällt mir die Angabe von Protkollen für die Laborarbeit (sowohl zur eigenen Versuchsdurchführung als auch zum Verständnis).

Dozentenbewertung

Bewertung

Kundenmeinung von M. Hartl

Guter Überblick über Biochemische Methoden verständlich präsentiert, praxisbezogen und auf das wesentliche fokussiert.

Dozentenbewertung

Bewertung

Kundenmeinung von T. Rodat

Das Buch bietet sowohl einen ausreichend weiten als auch einen genügend vertiefenden Einblick in die Molekularbiologischen Methoden.
Der Autor versteht es dabei die einzelnen Methoden anschaulich zu beschreiben, als auch hilfreiche Tipps zu streuen, die das Arbeiten im Labor deutlich erleichtern.

Dozentenbewertung

Bewertung

Kundenmeinung von D. Kostner

Ein ausgezeichnetes Buch für das praktische Arbeiten im Labor, bestens geeignet für Studenten und Doktoranden. Alle wichtigen Methoden werden ausführlich beschrieben, Hintergründe herausgearbeitet und praktische Tipps weitergegeben. Ein Muss für jeden der sich mit Molekularbiologie in der Praxis beschäftigt!

Hilfreich bei der Prüfungsvorbereitung

Bewertung

Kundenmeinung von Nicole Cichon

Nicht nur für Biologen oder die Arbeit im Labor, sondern auch sehr hilfreich bei der Vorbereitung für die Mikrobiologie-Prüfung der Tiermediziner, ist dieses Buch über mikrobiologische Methoden. Zu Beginn werden die Grundlagen der Genetik, die das Verständnis des Folgenden erleichtern, dargelegt. Die Methoden des Erregernachweises wie zum Beispiel PCR, ELISA und Western Blot werden leicht verständlich in kompakten Texten erklärt. In „Gut zu Wissen-“, „Protokoll-“ und „Tipp-“ Boxen werden Hintergründe, zusätzliche Informationen und praktische Tipps gegeben. Weitere zusätzliche Informationen finden sich im Online-Zusatzmaterial.
Dieses Buch kann ich als zusätzliches Nachschlagewerk für die Mikrobiologie empfehlen.

Dozentenbewertung

Bewertung

Kundenmeinung von A. Hallmann

Methodenbuch das die wichtigsten Methoden der Molekularbiologie kurz und gut beschreibt.
Hintergründe und Wirkmechanismen könnten aber noch besser beschrieben werden. Anschauliche Darstellungen.

Dozentenbewertung

Bewertung

Kundenmeinung von A. Lämmel

Das Buch schlägt hervorragend die Brücke zwischen den Lehrbüchern zu den Grundlagen der Gentechnik und den Arbeitsanleitungen für das molekularbiologische Labor. Übersichtlich, klar strukturiert, optimal vor allem für Studenten, als Unterstützung für das erste praktische Arbeiten im Labor.

Dieses Buch hat mich nicht enttäuscht

Bewertung

Kundenmeinung von Lisa

Ich habe mir dieses Buch bestellt, um einige Hintergünde über molekularbiologische Methoden zu erfahren und wurde nicht enttäuscht.

Das Buch ist logisch aufgebaut, bietet zu Anfang einen kompakten Überblick über die zu analysierende Materie, danach gibt es eine Übersicht über die üblichen Laborgeräte und über allgemeines Arbeiten im Labor, bevor es an die Hauptthemen geht. Auch die einzelnen Kapitel gehen inhaltlich vom Einfachen zum Komplizierten. Meiner Meinung nach sind alle wichtigen Methoden zur Bearbeitung von DNA/RNA, Plasmiden, Proteinen usw zur Genüge behandelt worden. Alle aktuellen Labormethoden werden hier gut verständlich beschrieben und mit Abbildungen und nützlichen Tabellen verdeutlicht. Gut finde ich, dass es häufig farbig unterlegte „Gut zu Wissen“ oder „Tipp“ – Texte gab, die nochmal auf wichtiges hinweisen. Besonders gut hat mir gefallen, dass es in vielen Kapiteln am Ende ein Unterthema „Wenn es mal nicht klappt …“ gibt, mit nützlichen Hinweisen zur Fehleranalyse, wenn eine Bestimmung mal nicht funktioniert haben sollte.

Es bietet ein Hintergrundwissen über das funktionieren der üblichen Analysenkits. Sollte einen eins dieser Kits mal verlassen, kann man auf die im Buch eingefügten Analysenprotokolle zurückgreifen und „per Hand“ eine Analyse versuchen. Allerdings brauch man hierfür schon ein wenig Ahnung von den Dingen, die man dann tun will.

Fazit: Das Buch ist nützlich beim Einstieg in die Laborarbeit und bietet so allerhand Kniffe und Tricks bei der Arbeit. Es eignet sich, um sich einem unbekannte Labormethoden anzulesen und auch auszuprobieren. Es eignet sich für Bachelorstudenten oder MTA`s/BTA`s.

Ein fantastisches Methodenbuch

Bewertung

Kundenmeinung von Tobias

Zu Beginn des Buches steht das Kapitel: „Das Leben und seine Bausteine“. Kurz zusammengefasst und dennoch hoch informativ werden auf wenigen Seiten alle wichtigen Details zu Genen, Proteinen und Nukleinsäuren beschrieben. Direkt im Anschluss an diesen Einstieg folgt „Grundlagen der Arbeit im Labor“. In diesem Kapitel werden die alltäglichen Werkzeuge und Methoden des modernen Naturwissenschaftlers erläutert und genauestens beschrieben. Diese beiden Kapitel bilden eine sehr schön erarbeitete Einleitung in die Arbeit im Labor
Nun geht’s ans Eigemachte! In den folgenden neun Kapiteln werden nun speziell Bereiche der molekularbiologischen Methoden hervorgehoben. Von der „Aufreinigung von Nukleinsäuren“ über „PCR“, „Klonieren für Anfänger“, „Vektoren“, „Elektrophorese von Nukleinsäuren“, „Proteinaufreinigung“, „Elektrophorese von Proteinen“, „Immunbiologischen Methoden“ bis hin zur „Molekularbiologie für Fortgeschrittene“ reicht das Spektrum dieses Buches. Jedes dieser Kapitel fängt mit einer Übersicht der Prinzipien und Zusammenhänge dieser Methodik an. Im weiteren Verlauf der einzelnen Kapitel wird auf die einzelnen Punkte dieser Abbildung näher eingegangen.
Überall im Buch findet man kleine Hinweis-„Boxen“, welche in drei Kategorien unterteilt sind. „Gut zu wissen“ liefert Hintergrundinformationen zu einzelnen Sachverhalten im Buch. „Tipp“ liefert wertvolle Tipps für die praktische Ausführung der beschriebenen Methoden. „Protokoll“ liefert detaillierte Informationen zur Vervollständigung wichtiger Verfahren. Zudem sind den einzelnen Kapiteln zahlreiche Bilder und Tabellen beigefügt, wodurch die beschriebenen Methoden nochmals verständlicher werden. Durch diese Hilfestellungen ist selbst der unerfahrene Labor-Frischling in der Lage sich an solche Methoden heranzuwagen.

Im Anhang des Buches findet man die 10 goldenen Regeln der Laborarbeit. Hier werden wichtige Verhaltensweisen im Labor erklärt. An dieser Stelle muss ich sagen: Endlich ein Buch in dem auch dieser äußerst wichtige Punkt beschrieben wird!
Damit jedoch nicht genug: Weitere Informationen, Methoden und Protokolle kann man in einem ausführlichen Online-Portal durchstöbern

Wer sollte sich dieses Buch besorgen? Ich würde dieses Buch jedem Biologiestudenten empfehlen, da man früher oder später mit einer der beschriebenen Methoden konfrontiert wird und dann ist es immer besser so ein Buch als Hilfe zu haben. Es eignet sich aber auch für die „alten Hasen“ im Labor als Nachschlagewerk.
Mein Fazit: Es handelt sich hierbei um ein fantastisches Methodenbuch, ich kann es nur weiterempfehlen!!!

Ein guter Begleiter für den Start in molekularbiologische Laborarbeit

Bewertung

Kundenmeinung von Florian

Das Buch ist eine gute Zusammenfassung der gängigsten molekularbiologischen Methoden und eignet sich meiner Meinung nach vor allem für diejenigen, die gerade die ersten praktischen Erfahrungen im Labor sammeln und eine gewisse theoretische Grundkenntnis der Molekularbiologie haben.

In den ersten beiden Kapiteln werden kurz und bündig die „Grundlagen der Arbeit im Labor“ und allgemeine Informationen über den Aufbau von DNA/RNA, Proteinen und Zellen vermittelt. Danach folgen Kapitle über Methoden die im Laboralltag eine wichtige Rolle spielen. Der konzeptionelle Aufbau des Buchs hat mir gut gefallen. Inhaltlich ist der überwiegende Teil des Buches leicht verständlich, manchmal jedoch oberflächlich. Der Schwerpunkt liegt eindeutig auf den Grundprinzipien der Methoden nicht auf den theoretischen Hintergrund. Zusätzlich wird der zu vermittelnde Inhalt durch zahlreiche beschriftete Grafiken und Tabellen unterstützt. Informative Hinweise für die Laborarbeit bzw. das Allgemeinwissen geben die „Gut zu wissen“ und „Tipp“-Boxen, welche immer wieder zusätzliche Informationen zum Kapitle beinhalten. Zu jedem Kapitel gibt es meist mehrere Online-Zusatzmaterialien, die in Art und Umfang dem Buch sehr ähnlich sind.

Insgesamt ist das Buch ein guter Begleiter für den Start in molekularbiologische Laborarbeit
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